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PCR實驗室分區(qū)之前如何設計合理的壓差梯度控制措施?

發(fā)表時間:2024/12/10  |  點擊率:1054

PCR實驗室 ,  或稱為 PCR擴增實驗室 ,  就是進行聚合酶鏈反應的實驗室場所,廣泛應用于生物學各個領域。例如艾滋病、乙型肝炎、禽疫病、癌基因的檢測和診斷、DNA指紋、個體識別、親子鑒定、法醫(yī)物證、動植物檢疫、動物及其衍生產(chǎn)品檢測、動物飼料、化妝品、食品衛(wèi)生檢測、轉基因作物與轉基因微生物檢測等。
一、工藝要求
1、PCR實驗室 ,  或稱為 PCR擴增實驗室 ,  就是進行聚合酶鏈反應的實驗室場所,廣泛應用于生物學各個領域。例如艾滋病、乙型肝炎、禽疫病、癌基因的檢測和診斷、DNA指紋、個體識別、親子鑒定、法醫(yī)物證、動植物檢疫、動物及其衍生產(chǎn)品檢測、動物飼料、化妝品、食品衛(wèi)生檢測、轉基因作物與轉基因微生物檢測等。該區(qū)域主要完成試劑和主反應混合液的儲存、配制和封裝工作 。所有運送到該區(qū)域的試劑和材料不應經(jīng)過其他區(qū)域,試劑和原材料應在本區(qū)內儲存和制備。本區(qū)域的氣壓應相對外界保持正壓。由于該區(qū)域有多種試劑,“安全" 應是平面設計首要考慮因素。平面設計時應保持通風流暢 、逃生暢通。首先實驗臺布置在房間的兩側,中間的過道全部通向走廊便于疏散。同時根據(jù)國際人體工程學的標準,實驗臺與實驗臺通道設計為 1500mm,中間的通道可滿足兩邊坐人中間過人的要求。
2、標本制備區(qū)
該區(qū)域的功能是樣本的保存 、核酸提取和貯存 、樣本加入擴增反應管和測定DNA 的合成 。樣本應直接運送至該區(qū)并儲存在本區(qū)內,不得經(jīng)過其他區(qū)域。對于氣流壓力的控制,由于在本區(qū)內加樣操作可能產(chǎn)生氣溶膠,為避免氣溶膠擴散出去對外界造成污染,本區(qū)應對外界保持負壓。從質量控制的角度而言,本區(qū)相對于擴增反應混合物配制和擴增區(qū)以及擴增產(chǎn)物分析區(qū)為正壓,以避免從鄰近區(qū)進入本區(qū)的氣溶膠污染。但當涉病原微生物時,標本制備區(qū)GB 19489-2008《實驗室生物安全通用安全》對BSL-2實驗室的各項安全要求,此時要本區(qū)相對于擴增區(qū)為負壓,故涉及病原微生物操作時 ,  在綜合考慮質量控制、生物安全因素的前提下,整體上標本制備區(qū)與擴增區(qū)的壓力應持平。即均為負壓,兩個相鄰房間之間的負壓值基本相當。
3、擴增區(qū)
該區(qū)域的功能是DNA擴增和擴增片段的測定。此外反應混合液  (來自試劑貯存和制備區(qū))  制備成反應混合液和已制備的DNA模板  (來自標本制備區(qū))  的加入等也可在本區(qū)內進行。對于氣流壓力的控制, 相對于鄰近區(qū)域為負壓,以避免氣溶膠從本區(qū)漏出。為避免氣溶膠所致的污染,應盡量減少在本區(qū)內不必要的走動。個別操作如加樣等應在超凈臺內進行。
4、產(chǎn)物分析區(qū)
該區(qū)域的功能是擴增產(chǎn)物的分析。該區(qū)域可能會用到某些可致基因突變的有毒物質,應特別注意實驗人員的安全防護。對于對于氣流壓力的控制,該區(qū)域是PCR實驗的最后一 步,壓力應為zui低,相對于鄰近區(qū)域為負負壓,以避免氣溶膠從本區(qū)漏出。為避免氣溶膠所致的污染,應盡量減少在本區(qū)內不必要的走動。
二、平面布局
1、功能分區(qū)要求
PCR實驗室原則上分為試劑準備區(qū)、樣品制備區(qū)、擴增區(qū)和擴增產(chǎn)物分析區(qū)四個工作區(qū)域, 各工作區(qū)域應設緩沖間,工作區(qū)與緩沖間宜安裝連鎖裝置。不同功能的工作區(qū)應是分隔獨立的,各工作區(qū)有明顯的標志,不能直通,如果緊密相連,需安裝物品傳遞窗。
前兩區(qū)為擴增前,后兩區(qū)為擴增后區(qū),擴增前區(qū)與擴增后區(qū)應嚴格分開。
實驗材料 、試劑、記錄紙、筆、清潔材料等,只能從擴增前區(qū)流向擴增后區(qū),即從試劑準備區(qū)、樣品制備區(qū)、擴增區(qū)輸送到擴展產(chǎn)物分析區(qū),不得逆向流動。實驗室的氣流也應從擴增前區(qū)流向擴增后區(qū),不得逆向流動。
試劑準備區(qū) 、擴增區(qū) 、擴增產(chǎn)物分析區(qū),空間可以相對小一些。
樣品制備區(qū)要放置生物安全柜和低溫冰箱,空間應大一些。通常每間面積為15~20m2 ,  整個區(qū)域面積為60~80m2 。
PCR實驗室區(qū)域的設置并不是一成不變的 ,  以下幾種情況需要說明:
(1)  如果樣本在擴增之前需要粉碎處理 ,  則需要增加一個區(qū)域用于樣品的粉碎。
(2)  如果采用實時熒光PCR法,則擴增區(qū)和分析區(qū)可以合并為一個區(qū)。
(3)  如果采用全自動化PCR分析儀,則標本制備區(qū)、擴增區(qū)和分析區(qū)可以合并為一個區(qū)。
2、緩沖間的設置
影響空氣在不同區(qū)域之間傳播污染的主要因素包括壓差、溫差以及門的卷吸作用和人的裹帶作用。壓差是空氣從高壓一側通過門窗縫隙流向低壓一側時的阻力,其隔離作用限制于房間的門、窗等開口處于關閉狀態(tài)時候,一旦門打開,兩個房間之間的壓差將瞬間降低為零。因此壓差屬于靜態(tài)隔離的一種措施,在開門狀態(tài)下起不到隔離作用。門開啟時, 由于溫差、門的卷吸作用和人的裹帶作用 ,  會引起短時間、大風量的室內外空氣交換,產(chǎn)生交叉污染。
由以上分析可知,實驗室門開啟時,必然會產(chǎn)生實驗室內空氣的外泄。因此,對于PCR實驗室,分區(qū)之前應分別設置獨立的緩沖間,保證緩沖間的門不同時開啟。同時可進一步設計合理的壓差梯度控制措施進行全過程的“動態(tài)隔離 "。在建筑設施上,緩沖間是阻隔室內外空氣流通即交叉污染的首要措施。因此 , 各工作區(qū)均需設置緩沖間。

 


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